熒光壽FLT測量及應用

熒光壽命(FLT)是熒光團在發射光子并返回基態之前花費在激發態的時間。根據熒光基團的不同，FLT可以從皮秒到數百納秒不等。

熒光團群的壽命是指經熒光或非輻射過程的能量損失后，激發態分子數量以指數方式衰減到原始數量的N / e（36.8％）的時間。

熒光壽命是熒光團的固有屬性。FLT不依賴于熒光團濃度、樣品吸收、樣品厚度、測量方法、熒光強度、光漂白和/或激發強度。它受外部因素影響，如溫度、極性和熒光淬滅劑的存在。熒光壽命對依賴于熒光團結構的內部因素敏感

確定熒光團熒光壽命的方法

熒光壽命可以在頻域或者時間域測量。

時間域測量方法涉及用短光脈沖照射樣品（比色皿、細胞或組織），然后隨時間測量發射強度。FLT由衰減曲線的斜率確定。有幾種熒光檢測方法可用于壽命測量，其中時間相關單光子計數（TCSPC）可實現簡單的數據收集和增強的定量光子計數。

頻域方法涉及高頻率入射光的正弦調制。在該方法中，發射發生在與入射光相同的頻率處，并且隨著激發光兼有相位延遲和振幅的變化（解調）

熒光壽命測量相對于基于強度測量的優勢

1.壽命測量不需要波長比率探針來提供眾多分析物的定量測定。

2.壽命法通過使用光譜位移探針擴展了分析物濃度范圍的靈敏度。

3.壽命測量可用于沒有直接探針的分析物。包括葡萄糖、抗原或基于熒光能量轉移轉導機制的任何親和力或免疫測定。

應用

熒光壽命分析：

熒光壽命是用于幾種生物測定的穩健參數。它有可能替代傳統的測量技術，如吸收法、冷光法或熒光強度法。熒光團物理化學環境的任何變化都會導致熒光壽命的改變。可通過各種機制來研發基于壽命的分析，例如簡單的結合測定，涉及到兩個組分的結合（一個被熒光標記）而引起FLT的變化。另一種機制是猝滅釋放型測定，涉及大量過量存在的猝滅物質，其具有低而有限的熒光。一旦熒光化合物被釋放（通過酶促反應或與互補DNA結合），系統的壽命就會改變。FLT可與FRET（熒光共振能量轉移）分析結合用于能量轉移效率測量。

熒光壽命感測：

該技術基于探針壽命或衰減時間的變化。納秒(ns)的衰減時間可以通過相位調制來測量。該技術已被廣泛用于檢測pH、Ca2+、K +、葡萄糖和其他代謝物。通過使用具有在近紅外區域激發和發射光譜的光學探頭，基于壽命的感測方法在組織和其他隨機介質中的應用已有新的發展。

熒光壽命成像（FLI）：

這種技術相對較新，涉及到同時在圖像的每個像素處確定熒光衰減時間的空間分布。它基于熒光團的熒光壽命取決于其分子環境而并非濃度的事實。它可以用于無法控制局部探針濃度的熒光顯微鏡中。熒光壽命成像顯微鏡(FLIM)可用于測量分子環境參數，通過熒光共振能量轉移(FRET)進行的蛋白質相互作用，并可以通過細胞和組織的自發熒光來測量其代謝狀態。分子環境參數可以通過因熒光淬滅或熒光團的構象變化而引起的壽命變化來測量。FLIM可用于多種生物應用，包括組織表面掃描、組織類型繪圖、光動力治療、DNA芯片分析、皮膚成像等。

弱發射體具有較短的熒光壽命，而壽命較長的熒光團具有較低的光子周轉率。由于其有限的靈敏度以及曝光和采集時間較長的必要性，它們對于壽命成像并不是很有用。